1、限制性内切酶反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2、DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性内切酶 1-2 u(单位)
加ddH2O 至 20 μl
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化3hr。
3、用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。
4、多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入;否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。
5、酶切结束时，加入0.5M EDTA(pH 8.0)使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
6、如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵(或1/10体积3M NaAc)和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中(pH 7.6)。
7、如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
1、电泳检测
取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体(如有)作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。
