1、（1）涂片：取洁净载玻片一张，用玻璃铅笔于玻片上划个直径37.5px左右的圆圈。用接种环在圆圈内各加1环生理盐水。接种环灭菌后，挑取细菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以25px2左右为宜。每次取菌前后注意将接种环灭菌。如果是液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上。
2、（2）干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
3、（3）固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰中通过3次。固定的目的在于杀死细菌，并使菌体与玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉，同时固定可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
1、（1）初染：将已固定的涂片置于染色架上或用染色夹子夹住，滴加石炭酸复红染液，并于载玻片下方以弱火加热至出现蒸气（勿煮沸或煮干）随时补充染液以防干涸，持续5min，水洗；
2、（2）脱色：用3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红色染液脱下为止（不可超过10min），水洗；
3、（3）复染：用吕氏美蓝复染0.5min，集菌涂片复染1～3min，水洗或印干（印干用的滤纸只能使用一次）用油镜检查并记录结果。
4、结果判定：被染成红色的细菌为抗酸染色阳性菌；被染成蓝色的细菌为抗酸染色阴性菌。
